知識的價值不在于占有,而在于使用。

生信自學網-速科生物-生物信息學數據庫挖掘視頻教程

當前位置: 主頁 > GEO >

單細胞測序技術發展|原理|應用

時間:2019-07-30 07:17來源:生信自學網 作者:樂偉 點擊:
近幾年來,單細胞測序技術發展迅速,與傳統測序方法相比起來,其對解決生物材料的低獲取量和生物異質性等問題尤為重要。憑借這一技術,研究者們可在單細胞水平上面研究生物進
一、單細胞測序技術的發展
早在 l9 世紀,部分學者通過顯微鏡就已經發現, 即使是同一組織也是由一些形態特征不同的細胞構成的。越來越多的研究表明,機體內每個細胞,即使是相同組織來源的細胞,彼此之間的基因組、表觀基因組和轉錄組都會有些許差異。由于細胞異質性的存在, 以往對由各種各樣不同的細胞混合而成的組織進行測序時,其分析結果會掩蓋各種不同細胞之間在功能上和基因組的差異和改變。因此,基于單細胞水平上的研究就顯得日益重要。單細胞測序技術是指在單個細胞水平上面對轉錄組或基因組進行擴增并測序,以檢測單細胞基因組結構變異、基因拷貝數變異(Copy number variants,CNVs)、單核苷酸變異(Single nucleotide variants,SNVs)、基因融合、基因表達水平、單細胞轉錄組選擇性的剪接、單細胞基因組的 DNA 甲基化狀態等。

如果需要入門單細胞測序數據分析,可以學習由生信自學網錄制的:
《單細胞測序數據分析視頻課程》
近幾年來,單細胞測序技術發展迅速,與傳統測序方法相比起來,其對解決生物材料的低獲取量和生物異質性等問題尤為重要。憑借這一技術,研究者們可在單細胞水平上面研究生物進程和一些疾病的發生發展,包括腫瘤進化和癌變,循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells,CTCs)、早期胚胎發育、神經細胞基因組異質性和不可培養的微生物等,而研究成果也在一定程度上顛覆了人們對這些生物現象的根本認識??傮w上講,單細胞測序技術可分為單細胞基因組測序和單細胞轉錄組測序。單細胞基因組測序是研究整體基因的基因突變情況, 包括基因插入和缺失、單核苷酸變異等。單細胞轉錄組測序一般針對的是細胞的調控基因,尤其是針對像早期胚胎細胞和腫瘤干細胞這類具有高度異質性的細胞群體而言。單細胞轉錄組測序有助于分析細胞的細胞分化、基因重組、基因調控網絡等過程。此外,單細胞轉錄組測序通過更精準的檢測率來顯示一些和轉錄相關的分子改變,如微小 RNA、信使 RNA、長鏈非編碼 RNA、內含子保留、融合基因、選擇性剪接等。單細胞轉錄組測序技術在技術層面需要克服很多困難,主要包括:起始 RNA 含量較少,通常只有 10Pg 左右;無法保證絕大部分 mRNA 都被逆轉錄生成 c DNA ;無法高效準確地得到全長 c DNA,而不是靠近位于 poly A 尾的斷裂的 c DNA。Picelli等和 Ramskold 等提出了一種命名為 Smart-Seq 的新的單細胞轉錄組測序方法,該方法較以往的方法相比起來具有更高的準確性和敏感性,從而大大地提高了轉錄基因的的讀序覆蓋度和準確度以及對基因多態性的識別能力。

二、單細胞測序技術的原理
單細胞測序主要包括單細胞基因組測序和轉錄組測序,通過對單個細胞內的DNA和RNA進行序列分析,分別揭示單個細胞的基因組和轉錄組的變化情況。單細胞全基因組測序是對選定的目的細胞的全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增,隨后利用外顯子捕獲技術進而高通量測序。單細胞轉錄組測序是利用高通量測序技術進行cDNA 測序,從而獲取特定器官或組織在某一狀態下的幾乎所有轉錄本,主要用于在全基因組范圍內挖掘基因調節網絡,尤其適用于存在高度異質性的干細胞及胚胎發育早期的細胞群體。與活細胞成像系統相結合,單細胞轉錄組分析更有助于深入理解細胞分化、細胞重編程及轉分化等過程及相關的基因調節網絡。

三、單細胞測序技術在腫瘤基礎研究中的應用
隨著人類基因組計劃(human?。纾澹睿铮恚濉。穑颍铮辏澹悖?,HGP)和國際人類基因組單體型圖計劃(the?。椋睿簦澹颍睿幔簦椋铮睿幔臁。龋幔穑停幔稹。穑颍铮辏澹悖簦┑耐瓿梢约案咄可镄酒夹g的成功研發,以全基因組測序為目標的基因組結構初步分析已經完成。研究發現,腫瘤是在細胞水平的惡性克隆,同時,惡性腫瘤細胞通過對自身的不斷的“改良”以適應宿主各種環境。從進化上來說,能夠引發惡性腫瘤的細胞即所謂“成功”的腫瘤細胞,其具備將遺傳模板傳遞給下一代腫瘤細胞的能力,而能夠引致遠處轉移的惡性腫瘤細胞其自身必定帶有其他腫瘤細胞亞群所不具備的信息。因此,在單克隆水平去分析這些腫瘤克隆的發生、發展、轉移等,有可能揭示惡性腫瘤產生的具體機制。由于惡性腫瘤本身的異質性,在原發灶的腫瘤細胞群可能是由具備血管生成、侵襲能力、轉移特性等不同方面的能力或是具備多功能的細胞亞群所組成。目前普遍認為,傾向于發生遠處轉移的一些細胞亞群在親代腫瘤中已然存在,不同的轉移灶可從不同的單個細胞增生而來,并且這些發生轉移的細胞亞群受多重機制的調控。如果能夠以單個細胞進行整個全基因組范圍的分析,不僅取材更經濟,更重要的是細胞可能達到真正的純化,實驗所得結果更精確也更可靠。因此,探索單個腫瘤細胞的遺傳信息并對其進行分析成為腫瘤基礎研究人員的夢想。

2011年,由紐約冷泉港實驗室、德州大學安德森癌癥研究中心開發并報道單細胞測序技術(single?。悖澹欤臁。螅澹瘢酰澹睿悖椋睿?,SNS),該技術能夠突破傳統癌癥基因組研究的如混合樣品測序無法判斷具體突變來源及頻率,無法解釋癌癥的發生、發展以及演化過程中的細節,難以區分主動與被動突變;細胞系測序無法除去體外培養時產生的新突變等問題。目前,對于惡性腫瘤單細胞測序已應用于神經膠質瘤、腎癌、血液腫瘤等惡性腫瘤的發病機制等的研究,同時,也有研究者將該技術應用于乳腺癌轉移機制方面的研究。將單細胞的純化技術聯合單細胞測序技術應用于腫瘤的相關機制研究必將能夠取得突破性進展。

四、單細胞RNA-Seq在臨床中的應用
隨著單細胞測序在腫瘤研究領域取得了驕人的成果,人們開始探索如何能把這項技術與臨床相結合,解決一些實際問題,給腫瘤患者帶來益處。在腫瘤的診斷、轉移早期監測、個體化治療等方面已有初步的嘗試。
1、腫瘤的早期診斷
在臨床上,癌癥早期患者病灶處往往只有少量的腫瘤細胞,因而難以診斷,常常會因為誤診、漏診而錯過最佳的治療時機,加快病情發展。在低級別的乳腺原位癌患者中,僅有5%~10% 會突破基底層而更具有侵襲性。Allred 等的研究表明,在乳腺癌的早期,個別腫瘤細胞確實會具有特殊的基因特征。因此,如果能利用從原位癌患者體內少量腫瘤細胞提取的DNA 或RNA 的信息,通過單細胞測序技術而檢測出是否含有那些具有高度侵襲性的腫瘤干細胞,就可以此對腫瘤的惡性程度做出判斷,及時地調整治療策略。通過對抽血或細針穿刺等微創方式獲得的樣本進行轉錄組分析,可以使患者得到快速的即時診斷(point-of-care diagnostic)。

2、利用循環腫瘤細胞監測惡性腫瘤的轉移
單細胞測序的另一個主要的應用方向就是通過對循環腫瘤細胞進行基因分析來達到監測腫瘤轉移的目的,使醫生能盡早地做出臨床干預來控制腫瘤轉移的發生。循環腫瘤細胞是指少量侵襲力強能夠突破原發灶釋放到循環系統中的腫瘤細胞,這類細胞非常稀少,估計與血細胞的比例為1:10 000 萬。盡管比例很低,但是還是可以通過一些特殊的表型分子標記來識別,這類標記分子往往與上皮- 間葉組織化生這一腫瘤轉移的特征性病理過程有關。早年間通過對化療后轉移到骨髓的腫瘤單細胞進行轉錄組微陣列分析就已經發現,細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase,EMMPRIN/CD147) 與腫瘤的侵襲性和化療抵抗性相關。對黑素瘤患者的CTC 進行RNA-Seq 發現,多種膜蛋白基因的異常表達與CTC 的侵襲性和逃避機體免疫監視的能力有關,研究者采用SMARTSeq 方案獲得了近乎全長的轉錄組,由此來尋找黑素瘤患者的CTC 存在哪些轉錄組單核苷酸多態性
(single nucleotide polymorphism, SNP) 可以有助于對腫瘤的監測。Cristofanilli 等[41] 已證明了檢測CTCs能提示轉移性乳腺癌患者的預后和對治療的反應。在趨勢抵抗性前列腺癌患者中,通過免疫磁珠富集測試CTC 水平比前列腺特異抗原PSA 對整體生存率有更好的預測作用。對CTCs 進行單細胞測序主要具有兩大應用價值。首先,比腫物活檢能得到純度更高的腫瘤細胞,且相比腹膜后淋巴結活檢大大簡化了操作過程;其次,對樣本質量的要求更低,無論是體積僅7.5 mL的血液還是穿刺液,都能夠對所含有的微量DNA或RNA 信息做出精確分析。

3、腫瘤異質性指導個體化治療
忽略腫瘤異質性是導致腫瘤治療效果不佳的潛在因素,會影響到患者的預后。如何將單細胞測序得到的腫瘤異質性信息運用到腫瘤的個體化藥物治療上成為目前研究的一個趨勢。Navin 等通過單細胞測序分析了2 例原發乳腺癌患者基因拷貝數變異,其中一例是單基因性,另一例是多基因性的,分為3 個不同的克隆亞群。Gerlinger 等發現了腫瘤存在多基因重建,63%~69% 的體細胞突變往往不能被探測到。Powell 等的研究表明,根據不同的基因表達類型可以將乳腺癌患者的CTCs 分為5 個亞群,以往組織活檢并不能反應單個癌細胞的基因表達情況,根據CTCs 不同的基因類型來制定治療策略顯得尤為重要。這些研究結果都提示:組成腫瘤的不同細胞都有不同的基因學改變,這些改變無法通過對腫瘤整體的檢測來發現,而且這些基因異質性有可能是導致治療失敗的原因。因此,對腫瘤患者進行單細胞測序有助于發現一些稀有的和耐藥性相關的基因, 以加強用藥的針對性。Dalerba 等建立了一套基于檢測幾種關鍵基因進行多變量分析計算危害比來預測結腸癌臨床預后的系統,預測效果要優于以往的病理分級制度,臨床醫生可以根據這套系統來判斷患者預后,以便及時制定或調整治療方案。

生信自學課程精品課程推薦:
《單細胞測序數據分析視頻課程》
《腫瘤微環境基于TCGA數據庫》
《單基因挖掘套路基于TCGA數據庫》
《m6A RNA甲基化分析》



責任編輯:樂偉
作者申明:本文版權屬于生信自學網(微信號:18520221056)未經授權,一律禁止轉載!
加生信自學網群
BioWolf二維碼生成器
頂一下
(3)
100%
踩一下
(0)
0%
------分隔線----------------------------
發表評論
請自覺遵守互聯網相關的政策法規,嚴禁發布色情、暴力、反動的言論。
評價:
表情:
用戶名: 驗證碼:點擊我更換圖片
TCGA腫瘤微環境
推薦內容
單基因發文套路
m6A